本文介绍的是3T3-L1脂肪细胞的诱导分化方案。3T3-L1细胞系源自小鼠胚胎成纤维细胞，具备从前脂肪细胞向脂肪细胞分化的特性。早在1974年，Green与Kehinde就从小鼠胚胎中成功分离了这一细胞系。因其在体外可以有效分化为脂肪样细胞，该细胞系成为研究脂肪细胞分化、代谢及与肥胖、糖尿病等代谢性疾病关系的重要工具。

在检测诱导分化效果时，有多种方法可供选择。其中，油红O染色是一种经典且直观的检测脂肪细胞内脂滴积累的方法。油红O能够特异性结合细胞内的中性脂质，形成红色脂滴，通过显微镜可以观察到脂滴数量和大小的增加，进而判断诱导分化是否成功。此外，利用分子标志物检测脂肪细胞特异性基因或蛋白的表达也是有效的方式，常用的基因标志物包括PPARγ（过氧化物酶体增殖物激活受体γ）、aP2（脂肪细胞脂肪酸结合蛋白）、LPL（脂蛋白脂肪酶）等。

本文将以六孔板为例，详细介绍3T3-L1细胞诱导分化为脂肪样细胞的实验步骤。

第一阶段：细胞培养

1. 将细胞以每平方厘米3×10³个的密度接种于六孔板中。 注意： (1) 建议使用早代次的细胞进行实验，以确保有效分化。
(2) 均匀铺板，避免因铺板不均导致分化不均。

2. 使用DMEM培养细胞，直到达到70%的汇合度，每2-3天更换一次培养基。3T3-L1细胞一般在DMEM高糖培养基中培养，并加入10%小牛血清，以促进细胞生长。当细胞在37℃、5% CO₂的培养箱中生长至90%汇合度时，即可进行分化诱导。

3. 分化前，细胞汇合度应当不超过70%，以减少分化后细胞死亡的风险。注意： (1) 使用高血清含量的培养基有助于脂肪积累。
(2) 细胞密度直接影响分化效果，汇合度过高或过低都会影响分化效率。

第二阶段：分化诱导培养基配制

培养基设置需在无菌条件下进行。MDI（甲基异丁基黄嘌呤、地塞米松、胰岛素）诱导培养基和胰岛素培养基应新鲜制备。

1. 制备储备溶液：在DMSO中按需制备IBMX（50 mM）和地塞米松（1 mM）的储备溶液。如果使用冻干胰岛素，请遵循制造商说明进行复溶。

2. 配置100 mL MDI诱导分化培养基：

• DMEM：100 mL
• IBMX（50 mM）：1 mL，最终浓度为5 mM
• 地塞米松（1 mM）：100 μL，最终浓度为1 μM
• 胰岛素：添加至最终浓度为10 μg/mL

第三阶段：3T3-L1细胞向脂肪样细胞的分化

1. 从培养箱中取出细胞培养板，去除DMEM培养基，并每孔添加2-3 mL MDI诱导培养基（记为第0天）。注意： (1) 添加诱导剂时，手法要轻柔，避免对细胞产生冲击。
(2) 使用前将诱导培养基预热至37℃以减少对细胞的刺激。

2. 第3天，从细胞中去除MDI诱导培养基，并用2-3 mL 胰岛素培养基替换。

3. 第6天，去除胰岛素培养基并添加新鲜的DMEM。

4. 大约在第7-10天，可以获得完全分化的脂肪样细胞。

5. 分化效果检测可通过油红O染色来监测脂质积累，或者通过检查脂肪细胞标志物（如脂联素和FABP4）的表达来确认。

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